Разница между ПЦР и QPCR

Основное различие - ПЦР против QPCR

ПЦР (полимеразная цепная реакция) и количественная ПЦР (количественная ПЦР) - это два метода, используемые в биотехнологии для амплификации ДНК для различных целей. ПЦР - относительно простой метод. qPCR также известен как ПЦР в реальном времени или цифровая ПЦР. В главное отличие между ПЦР и КПЦР заключается в том, что ПЦР - это качественный метод, тогда как qPCR - количественный метод.. ПЦР позволяет прочитать результат как «наличие или отсутствие». Но в qPCR количество ДНК, амплифицированной в каждом цикле, определяется количественно. Если в ПЦР используется РНК, метод известен как ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией), а если РНК используется в КПЦР, метод известен как qRT-PC.

Ключевые области покрыты

1. Что такое ПЦР - Определение, процессы, использование 2. Что такое QPCR - Определение, процессы, использование 3. Каковы сходства между ПЦР и КПЦР - Обзор общих черт 4. В чем разница между ПЦР и КПЦР - Сравнение основных различий

Ключевые термины: электрофорез в агарозном геле, ампликоны, ДНК-полимераза, флуоресцентный краситель, ПЦР, зонды, qPCR, RT-qPCR.

Что такое ПЦР

ПЦР - это метод в биотехнологии, который позволяет анализировать короткую последовательность ДНК путем амплификации выбранного сегмента ДНК. Это сравнительно чувствительный метод, поскольку для одной реакции требуются очень небольшие объемы. Этот метод основан на способности ДНК-полимеразы синтезировать новые цепи ДНК с предложенной цепью матрицы комплементарным образом. Реакционная смесь ПЦР состоит из ДНК-полимеразы, нуклеотидов ДНК, праймеров, матрицы ДНК, которая должна быть амплифицирована, и магния. Амплификация осуществляется в термоциклере. ДНК-полимераза должна быть термостойкой, поскольку в этой реакции используются высокие температуры. В ПЦР используются два типа ДНК-полимераз: ДНК-полимераза Taq и ДНК-полимераза Pfu. ДНК-полимераза Taq широко используется в ПЦР.

ДНК-полимеразе требуется уже существующая цепь ДНК на 3'-конце, чтобы синтезировать новую цепь. Следовательно, к реакционной смеси добавляют олигонуклеотидный праймер для инициации синтеза ДНК. Требование праймера в ПЦР позволяет амплифицировать только конкретную область в матрице. Целевая последовательность фланкируется прямым и обратным праймерами. В конце ПЦР новые копии определенной последовательности ДНК, которые называются ампликоны, накапливаются в миллиардах. Компоненты ПЦР должны быть оптимизированы таким образом, чтобы повысить производительность ПЦР при минимизации сбоев. Стандартная реакция ПЦР показана на рисунке 1.

Рисунок 1: ПЦР

Этапы ПЦР

Ниже описаны три этапа ПЦР.

Денатурация - Матрица двухцепочечной ДНК разделяется на две одноцепочечные цепи путем нагревания до 94-95 ° C.
Отжиг - Прямой и обратный праймеры связываются с комплементарными последовательностями в матрице. Температура зависит от температуры плавления комбинации грунтовок.
Удлинение грунтовки - Фермент ДНК-полимераза удлиняет каждый праймер на их 3’-конце, добавляя комплементарные основания к растущей цепи. Оптимальная температура полимеразы Taq, то есть 72 ° C, используется в качестве температуры на стадии удлинения. Время удлинения зависит от количества пар оснований в цепи-шаблоне.

Три шага повторяются 28-35 раз. Электрофорез в агарозном геле используется при фракционировании продуктов ПЦР по размеру. Продукт окрашивается бромистым этидием и наблюдается в УФ-свете. Продукт ПЦР или амплифицированная ДНК можно использовать при клонировании, секвенировании или генотипировании.

Что такое QPCR

QPCR относится к методу в биотехнологии, который позволяет обнаруживать, характеризовать и количественно определять нуклеиновые кислоты для различных приложений. Следовательно, это тип количественной ПЦР. И ДНК, и РНК могут использоваться в качестве КПЦР. Если в качестве матрицы используется РНК, ее сначала следует обратным образом транскрибировать в кДНК. Таким образом, этот тип КПЦР известен как ОТ-КПЦР. Традиционная ПЦР проводится для кДНК или обычного образца ДНК. Однако в qPCR флуоресцентные красители используются для маркировки продукта PCR на каждом этапе цикла PCR. Это позволяет собирать данные по мере продвижения ПЦР, позволяя количественно определять ампликоны во время экспоненциальной фазы ПЦР. Основным типом красителя, используемого в кПЦР, является SYBR Green. Краситель связывается с двухцепочечной ДНК. Поскольку флуоресценция увеличивается пропорционально количеству амплифицированной ДНК, количественное определение можно проводить в «реальном времени». Основным недостатком использования красителя является то, что он позволяет количественно определять один конкретный продукт в образце. Помимо красителей, в процессе количественной оценки также можно использовать зонды. Зонды TaqMan являются одним из основных типов олигонуклеотидных зондов, используемых в кПЦР, и процесс испускания флуоресценции показан на рисунке 2.

Рисунок 2: Датчик TaqMan

Зонды могут быть сконструированы таким образом, чтобы обнаруживать несколько продуктов ПЦР в одном образце. Зонд TaqMan - один из основных типов зондов гидролиза; включение этого зонда в продукт ПЦР обнажает флуорофор, испускающий флуоресценцию. Флуоресцентные красители более специфичны для продукта ПЦР. Следовательно, они используются в большинстве диагностических тестов для обнаружения продукта ПЦР.

Сходства между ПЦР и QPCR

Определение

ПЦР: ПЦР - это метод в биотехнологии, который позволяет анализировать короткую последовательность ДНК путем амплификации выбранного сегмента ДНК.

QPCR: QPCR - это метод в биотехнологии, который позволяет обнаруживать, характеризовать и количественно определять нуклеиновые кислоты для различных приложений.

Количественный качественный

ПЦР: ПЦР - качественная методика.

QPCR: QPCR - это количественный метод.

Обнаружение продукта

ПЦР: Продукт обнаруживают электрофорезом в агарозном геле в ПЦР.

QPCR: Продукт может быть обнаружен в каждом цикле амплификации в КПЦР.

Сбор данных

ПЦР: Данные собираются в конце реакции в ПЦР.

QPCR: Данные собираются во время экспоненциальной фазы реакции в КПЦР.

разрешение

ПЦР: ПЦР имеет очень плохое разрешение.

QPCR: QPCR имеет очень высокое разрешение.

Красители

ПЦР: ПЦР использует бромистый этидий для окрашивания продукта во время ПЦР.

QPCR: QPCR использует флуоресцентные красители для обнаружения продукта.

Время

ПЦР: ПЦР - более трудоемкий метод.

QPCR: QPCR занимает меньше времени.

РНК

ПЦР: ОТ-ПЦР - это тип ПЦР, в котором в качестве матрицы используется РНК.

QPCR: RT-qPCR - это тип qPCR, который использует РНК в качестве шаблона.

Роль

ПЦР: ПЦР используется для обнаружения наличия или отсутствия определенных геномных фрагментов.

QPCR: QPCR используется для количественной оценки конкретного фрагмента в образце.

Заключение

ПЦР и кПЦР - это два типа методов, используемых в биотехнологии для амплификации ДНК для различных целей. ПЦР - это традиционный метод амплификации, используемый для определения наличия или отсутствия фрагмента ДНК. QPCR используется для количественной оценки конкретного фрагмента в образце. Таким образом, ПЦР - это качественный метод, тогда как qPCR - количественный метод. В этом основное различие между ПЦР и КПЦР.

Ссылка:

1. «QPCR против цифровой PCR против традиционной PCR». Thermo Fisher Scientific, доступно здесь.

Изображение предоставлено:

1. «PCR» от Madprime - собственная работа (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia2. «Taqman» от пользователя: Braindamaged - собственная работа автора, загрузившего видео (общественное достояние) через Commons Wikimedia