Основное различие - ПЦР против ОТ-ПЦР

ПЦР и ОТ-ПЦР - два важных метода в молекулярной биологии. ПЦР был разработан Кэри Маллис в 1980-х годах. Он способен увеличивать количество копий конкретного гена в геометрической прогрессии, облегчая обнаружение этого конкретного фрагмента ДНК. Taq-полимераза - это фермент, наиболее часто используемый в системах ПЦР. Это термостабильный фермент. В ОТ-ПЦР за обратной транскрипцией следует ПЦР. Фермент обратная транскриптаза участвует в синтезе комплементарной ДНК из РНК. В главное отличие между ПЦР и ОТ-ПЦР заключается в том, что ПЦР использует двухцепочечную ДНК в качестве матрицы, тогда как ОТ-ПЦР использует РНК в качестве матрицы.

Ключевые области покрыты

1. Что такое ПЦР - Определение, процесс, применение 2. Что такое ОТ ПЦР - Определение, характеристики, применение 3. В чем разница между ПЦР и ОТ ПЦР? - Сравнение основных различий

Ключевые термины: ПЦР, ОТ-ПЦР, полимеразная цепная реакция, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, ДНК-матрица, ДНК-полимераза, денатурация, отжиг, удлинение праймера.

Что такое ПЦР

ПЦР (Полимеразной цепной реакции) - относительно простой, но революционный метод. ПЦР использует способность фермента, ДНК-полимеразы, синтезировать новые цепи ДНК, дополняя предложенную цепочку матрицы. ПЦР - незаменимый метод, используемый как в клинических, так и в исследовательских лабораториях для функционального анализа генов, диагностики и мониторинга наследственных заболеваний, клонирования ДНК, секвенирования и амплификации древней ДНК. ДНК-матрица, нуклеотиды, праймеры и ДНК-полимераза - четыре основных компонента ПЦР. В Шаблон ДНК обычно представляет собой двухцепочечную ДНК с целевой последовательностью, которую необходимо амплифицировать. ДНК-полимераза Taq который изолирован от Thermus aquatics, обычно используется в ПЦР. В ДНК-полимераза Pfu другой тип ДНК-полимеразы с высокой точностью воспроизведения. Полимеразы Taq и Pfu термостойки. Нуклеотиды, добавленные ДНК-полимеразами, представляют собой аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и тимин (T). Поскольку ДНК-полимераза может добавлять новый нуклеотид только к 3'-концу уже существующей цепи ДНК, для инициации синтеза ДНК требуется олигонуклеотидный праймер. Требование праймера в ПЦР позволяет выделить только конкретную область в матрице. Целевая последовательность фланкируется прямым и обратным праймерами. В конце ПЦР новые копии, называемые ампликонами определенной последовательности ДНК, накапливаются в миллиардах. Компоненты ПЦР должны быть оптимизированы таким образом, чтобы повысить производительность ПЦР при минимизации сбоев.

ПЦР - это автоматизированный процесс, выполняемый термоциклерами, которые могут переключаться между различными температурами. ПЦР - это трехэтапный процесс.

1. Денатурация - Матрица двухцепочечной ДНК разделяется на две одноцепочечные цепи путем нагревания до 94-95 ° C.
2. Отжиг - Прямой и обратный праймеры связываются с комплементарными последовательностями в матрице. Температура этого этапа зависит от температуры плавления комбинации грунтовок.
3. Удлинение грунтовки - Фермент ДНК-полимераза удлиняет каждый из праймеров на их 3’-конце, добавляя дополнительные основания к растущей цепи. Оптимальная температура полимеразы Taq, 72 ° C, используется в качестве температуры на стадии удлинения. Время удлинения зависит от количества пар оснований в цепи-шаблоне.

Три шага повторяются 28-35 раз.

Рисунок 1: Полимеразная цепная реакция

Продукты ПЦР фракционируют по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле по сравнению с ДНК-лестницей. Визуализация ДНК на агарозном геле осуществляется путем окрашивания бромистым этидием и наблюдения в УФ-свете. Полосы амплифицированной ДНК под УФ-светом в геле, окрашенном бромистым этидием, показаны на рисунке 2. Лестница ДНК показана в самой левой лунке.

Рисунок 2: полосы ДНК

Что такое ОТ-ПЦР

ОТ-ПЦР (Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) является одним из наиболее чувствительных методов, используемых для обнаружения мРНК. РНК является подходящей матрицей для сбора информации либо об экспрессии генов нормальной ткани, либо об экспрессии генов инфицированной ткани. Матрицей для ОТ-ПЦР может быть либо общая РНК, либо вирусная или бактериальная РНК соответственно. РНК обратно транскрибируется в комплементарную ДНК (кДНК) ферментом обратной транскриптазой. Оптимальная температура обратной транскриптазы 46 ° C. КДНК используется в ПЦР для получения продукта. Этапы ПЦР с обратной транскрипцией показаны на рисунке 3.

Рисунок 3: ОТ-ПЦР

ОТ-ПЦР может быть проведена в виде двух- или одностадийных реакций. В двухэтапной реакции обратная транскрипция и ПЦР выполняются в два отдельных этапа. В одноэтапной ОТ-ПЦР за обратной транскрипцией следует последовательная ПЦР в одной пробирке. Как кДНК, так и конечный продукт ПЦР можно запускать на агарозном геле для фракционирования по размеру и целей визуализации. Одноэтапная и двухэтапная ОТ-ПЦР показаны на рисунке 4.

Рисунок 4: Одноэтапная и двухэтапная ОТ-ПЦР

Разница между ПЦР и ОТ-ПЦР

Определение

ПЦР: ПЦР - это метод, используемый в молекулярной биологии для амплификации сегмента ДНК, генерирующего миллионы копий последовательности ДНК.

ОТ-ПЦР: ОТ-ПЦР - это вариант ПЦР, используемый для определения экспрессии генов в молекулярной биологии.

Шаги

ПЦР: Денатурация, отжиг и удлинение - это три этапа ПЦР.

ОТ-ПЦР: В ОТ-ПЦР за обратной транскрипцией следует ПЦР.

Шаблон

ПЦР: Двухцепочечная молекула ДНК служит матрицей для ПЦР.

ОТ-ПЦР: Молекула одноцепочечной РНК служит матрицей для обратной транскрипции. Одноцепочечная молекула ДНК служит матрицей для ПЦР.

Используемые ферменты

ПЦР: ДНК-полимераза используется в качестве фермента в ПЦР.

ОТ-ПЦР: Обратная транскриптаза и ДНК-полимераза используются в качестве ферментов в ОТ-ПЦР.

Грунтовки

ПЦР: В ПЦР используются прямые и обратные праймеры.

ОТ-ПЦР: Для обратной транскрипции используется только обратный праймер, а в ПЦР используются как прямой, так и обратный праймеры.

Чувствительность

ПЦР: ПЦР - чувствительный метод.

ОТ-ПЦР: ОТ-ПЦР более чувствительна, чем ПЦР.

Приложения

ПЦР: ПЦР используется для функционального анализа генов, диагностики и мониторинга наследственных заболеваний, клонирования ДНК, секвенирования ДНК и амплификации древней ДНК.

ОТ-ПЦР: ОТ-ПЦР используется для определения экспрессии генов.

Заключение

ПЦР и ОТ-ПЦР - два важных метода, используемых в молекулярной биологии. И ПЦР, и ОТ-ПЦР представляют собой автоматизированные методы, способные экспоненциально увеличивать количество копий целевой последовательности ДНК, которая определяется прямым и обратным праймерами. В ПЦР в качестве матрицы используется двухцепочечная ДНК. С помощью ПЦР можно проводить клонирование ДНК, секвенирование ДНК и функциональный анализ генов. В ОТ-ПЦР экспрессию гена в конкретной ткани можно наблюдать путем амплификации РНК. Основное различие между ПЦР и ОТ-ПЦР заключается в их шаблонах, используемых в каждой реакции и их применениях.

Ссылка:

1. «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)». Национальный центр биотехнологической информации. Национальная медицинская библиотека США, без даты. Интернет. Доступна здесь. 01 июня 2017 г. 2. «Полимеразная цепная реакция (или ПЦР)». Клонирование и молекулярный анализ генов. N.p., n.d. Интернет. Доступна здесь. 01 июня 2017 г. 3. Биолаборатории, Новая Англия. «Синтез КДНК и ОТ-ПЦР». Синтез КДНК и ОТ-ПЦР | NEB. N.p., n.d. Интернет. Доступна здесь. 01 июня 2017.

Изображение предоставлено:

1. «Полимеразная цепная реакция» Энзоклоп - собственная работа (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia 2. «ДНК фрагмендида etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis». Автор: Райнис Вента - собственная работа (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia 3. «Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией» Автор Jpark623 - собственная работа (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia 4. «Один шаг против двухэтапного RT-PCR »Автор: Jpark623 - собственная работа (CC BY-SA 3.0) через Commons Wikimedia